Диагностика вируса гепатита С

Вирус гепатита С (ВГС) – является РНК-содержащим вирусом из семейства Flaviviridae. Эта инфекция способна размножаться в клетках крови (моноцитах, нейтрофилах, В-лимфоцитах и макрофагах), а также поражать клетки самой печени – гепатоциты. Благодаря высокой степени мутационной активности данный тип гепатита способен избегать воздействия иммунной системы человека.

Есть 11 генотипов и масса субтипов такого вируса, которые отличаются степенью поражения печени и влияют на сроки лечения гепатита. Подобное разнообразие гепатита С требует различных методик противовирусной терапии. К примеру, гепатит 1-го и 4-го генотипов необходимо лечить 48 недель, а для курса терапии против вирусов 2-го и 3-го видов может потребоваться лишь 24 недели.

После того, как экспресс-тест на гепатит С дал положительный результат, проводят анализ ПЦР с целью выявления РНК данного вируса в пробах крови.

ПЦР-диагностика

Полимеразной цепной реакцией (ПЦР) называется экспериментальная методика для выявления вирусов. Такой анализ на гепатит С позволяет существенно увеличить концентрацию некоторых фрагментов ДНК или РНК вируса в сданных пробах. Это дает возможность их распознать и даже подсчитать количество.

кровь с пальца

Данный тест на гепатит С выполняют по следующей методике:

  1. Проба крови (генетический материал), который может содержать искомый ген гепатита, вносится в пробирку. К ней помещают специальные вещества – праймеры, они представляют собой отрезки небольшой длины из искомого гена, которые синтезированы химическим путем. В данный сосуд также добавляется ДНК или РНК полимераза, она способна выстраивать цепочки из нуклеиновой кислоты, полностью идентичные первоначальной. К полученному составу добавляется и подборка из свободных нуклеотидов, являющихся особым строительным материалом для ДНК и РНК, причем один из них содержит мельчайшие частицы из радиоактивного фосфора.
  2. Полученная смесь вначале подогревается до 95 градусов, вследствие чего переплетенные в обычном состоянии обе спирали ДНК из-за такого воздействия расплетаются.
  3. Для продолжения анализа препарат охлаждается, в этот момент праймеры прикрепляются к искомому участку генома вируса гепатита, не позволяя ДНК сформироваться в двойную спираль. Когда происходит остывание смеси, полимераза отыскивает именно одиночные цепочки из нуклеотидов. Во время прикрепления данного фермента он скользит по цепи ДНК (как блок по веревке), а на двойной спирали он не способен «работать», для этого и проводят подогрев смеси.
  4. Чтобы продлить анализ, выполняют повторное нагревание, которое вновь приводит к разделению цепочек нуклеотидов. При выполнении таких циклов ПЦР в пробе количество искомых генов гепатита возрастает в геометрической пропорции, а остальные генетические материалы продуцируются (формируются) лишь в линейной закономерности.
  5. Для завершения исследования проводят очистку раствора от остаточных частиц нуклеотидов. Их разделяют с помощью электрофореза, при этом происходит отделение по параметрам молекулярной массы цепочек ДНК. Такие анализы на гепатит с при помощи ПЦР позволяют определить, присутствуют искомые гены вируса в исследуемом образце или нет.

нагревание частиц

Достоинством данного теста является очень высокий порог чувствительности реакции ПЦР. Такой методике для проведения диагностики, в идеальном варианте, требуется всего одним геном вируса на всю пробу.

Кроме того, такая ПЦР полностью специфична. В каждом из генов есть уникальная последовательность из нуклеотидов, которая, как отпечаток пальца, не может нигде повторяться. Для этого анализа на гепатит С праймеры синтезируются таким образом, чтобы они абсолютно соответствовали уникальным участкам искомых генов, которых нет ни у одной другой последовательности.

Данная методика позволяет также провести анализ на гепатит в с и детерминировать их, помогая установить окончательный диагноз.

Такой лабораторный анализ позволяет получить информацию большую, чем просто наличие или отсутствие РНК вируса гепатита С либо другого типа в пробах крови. Определяя параметр радиоактивного излучения, существует и возможность выявлять, сколько искомого генетического материала изначально находилось в исследуемом образце. Это позволяет определить параметр так называемой вирусной нагрузки – концентрации частиц РНК гепатита в определенном объеме.

Качественный анализ ПЦР

Данный анализ позволяет определить факт наличия вируса гепатита в пробах крови. Его необходимо проводить для всех людей, у которых были обнаружены антитела к гепатиту.

колбы с анализами

В результате проведения такого исследования могут быть только два значения:

  • «Обнаружено». Такой положительный результат теста интерпретируется следующим образом: в анализируемом образце из биологического материала были найдены фрагменты РНК вируса гепатита. Из этого следует, что был факт инфицирования пациента данным вирусом. Это может свидетельствовать о том, что возбудитель гепатита размножается в организме и заражает новые клетки, разрушая печень.
  • «Не обнаружено». Этот результат говорит, что в образце, который анализировался в данной лаборатории, не были обнаружены фрагменты РНК, которые специфичны для вируса гепатита С. Есть также вероятность, что концентрация РНК вируса-возбудителя в исследуемом образце была настолько мала, что тест не смог ее выявить. В таких случаях говорят, что уровень концентрации находится ниже порога чувствительности анализа.

Такой тест может быть также и ложноположительным или ложноотрицательным, из-за загрязнения биоматериала или наличия в пробах специфических веществ, реагирующих с химическими компонентами, необходимыми для проведения анализа.

Следует подчеркнуть, что в острых фазах гепатита С качественное исследование по методу ПЦР может выявлять его РНК уже после 1-2 недель от момента инфицирования организма. Это значит, что выявлять болезнь можно задолго до проявления ее внешних симптомов или появления в организме антител к гепатиту.

Забор крови (из вены) желательно выполнять натощак.

Количественный анализ ПЦР

При помощи данного анализа определяют уровень концентрации вируса гепатита у больного (вирусную нагрузку). Такой тест нужно сдать, чтобы оценить количество РНК вируса в единице определенного объема.

Расшифровка анализов на гепатит с, проведенная по такой методике, может иметь следующие результаты:

  • Количественный показатель (в цифрах)
  • Концентрация вируса (количество) приводится в цифровом выражении. Для этого используются разные показатели единиц измерения: либо МЕ/мл (международная единица на миллилитр), либо копий/мл (количество копий РНК вируса в миллилитре). В среднем 1 МЕ/мл соответствует 4 копиям/мл, поскольку разные тест системы имеют различные коэффициенты перевода таких единиц измерения.

    Низким уровнем вирусной нагрузки считают значения данного анализа меньше 400000 МЕ/мл, а высоким является показатель 8000000 МЕ/мл.

    работники в лаборатории

    Такая количественная оценка позволяет определить уровень инфекционности заболевания («заразность») больного. Чем больше этот показатель анализа, тем выше вероятность риска передачи возбудителя другим людям (при половом контакте или вертикальным путем).

  • Результат «Ниже диапазона измерений»
  • Этот вердикт означает, что количественный метод не смог обнаружить РНК гепатита, однако сам вирус присутствует в организме, только в очень малой концентрации. Это было подтверждено проведением дополнительного качественного анализа ПЦР, и он своим положительным результатом свидетельствует о факте присутствия гепатита.

  • Результат «Не обнаружено»
  • Данная положительная расшифровка анализа говорит о том, что сам количественный тест в пробе крови не смог обнаружить специфических РНК частиц вируса гепатита С.

Количественный анализ ПЦР, проводимый на разных сроках противовирусной терапии (1-я, 4-я, 12-я и 24-я недели) позволяет судить об эффективности лечения и делать необходимые поправки.

Специфика анализа

Данный тест нужно сдать, чтобы определить различные генотипы гепатита С. В настоящее время известно 11 генотипов данного возбудителя и множество субтипов. В нашей стране распространены генотипы гепатита С 1-го, 2-го и 3-го видов. В лабораториях могут выявлять разнообразные субтипы этих видов: 1а, 1в, 2а, 2в, либо 3, 4, 5, 6 генотипы с различными модификациями субтипов. Для всех этих гепатитов специфичность определения составляет 100%.

Уточнение модификации генотипа дает возможность подбирать соответствующее лечение. Наличие у больного тех или иных видов генотипа не свидетельствует от том, что заболевание легче или сложнее, они являются лишь разновидностями вируса гепатита, и не больше.

В тех случаях, когда в лаборатории не могут выделить генотип вируса, может быть выдан результат: «Не типируется. Были исследованы генотипы: такие-то» (к примеру, 1а, 2в, 3ав). Эта расшифровка говорит о том, что в данной лаборатории не было соответствующих реагентов, которые смогли бы детерминировать генотип вируса гепатита. При исследовании проводилась проверка на вирусы, данные в перечне, но соответствия их с образцами РНК не были выявлены.

Чтобы поставить окончательный диагноз, недостаточного лишь одного вида анализа. Каждый из тестов может дать ложноположительный результат. Для точного определения типа гепатита и степени поражения этой инфекцией организма проводят комплексное исследование. При этом делается биопсия печени и тестирование ее ферментов: АлАТ, АсАТ, а также ЩФ и ЛДГ. Может выполняться также тест на билирубин и анализ протромбинового индекса.

Лишь комплекс таких тестов и лабораторных исследований, с общим анализом состояния больного поможет определить наличие гепатита в организме, его форму, а также степень выраженности. На их основании доктор может определить дальнейшее лечение и сделать возможный прогноз для больного.